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Retinoblastoma (Rb) regula la reorganización laminar dendríticas cenador en las neuronas de la retina horizontales Abstracto La diferenciación neuronal con respecto a la adquisición de la competencia sináptica necesita ser regulada con precisión durante la neurogénesis para asegurar la formación adecuada de los circuitos en el lugar y momento adecuado en el desarrollo. Esta regulación es particularmente importante para las tríadas sinápticas entre fotorreceptores, células horizontales (HC), y células bipolares en la retina, porque los HC son uno de los primeros tipos de células producidas durante el desarrollo, y células bipolares están entre el último. HC experimentan una transición dramática de neuritas orientados verticalmente que forman cenadores columnares a la superposición laminares cenadores dendríticas con la diferenciación. Sin embargo, cómo se regula y coordina con la diferenciación de los fotorreceptores y células bipolares este proceso sigue siendo desconocido. Estudios anteriores han sugerido que el gen supresor de tumor retinoblastoma (Rb) puede jugar un papel en la diferenciación celular horizontal y la sinaptogénesis. Al combinar el análisis del mosaico genético de tríadas sinápticas individuales con los análisis neuroanatómicas y multifotónica imágenes en vivo de los HC en desarrollo, se encontró que Rb juega un papel autónomo de la célula en la reorganización de las neuritas de células horizontales, ya que diferenciar. procesos verticales aberrante en HC deficientes Rb forman sinapsis ectópicos con barras en la capa nuclear externa, pero carecen de dendritas bipolares. Aunque los informes anteriores indican que las anomalías fotorreceptoras pueden desencadenar la formación de sinapsis ectópicos, nuestros estudios ahora demuestran que los defectos en un socio postsináptica contribuyen a la formación de sinapsis fotorreceptoras ectópicos en la retina de mamífero. La diferenciación neuronal y la sinaptogénesis deben ser coordinados con precisión durante el desarrollo para asegurar que los circuitos neuronales adecuadas se forman y se mantienen a través de toda la vida de un organismo. En retinas de vertebrados, los defectos en la diferenciación o función de los fotorreceptores pueden afectar a la formación de tríadas sinápticas estables. Por ejemplo, obeso 2 (nob2) ratones Nueva Zelanda tienen una mutación en el canal de calcio, dependiente de la tensión, el tipo L, subunidad alfa 1F (Cacna1f) (1) que codifica un canal de calcio dependiente de voltaje de tipo L que regula la entrada de calcio en los fotorreceptores tríadas sináptica. nob2 ratones tienen sinapsis ectópicos en la capa nuclear externa (ONL), que comparten características con las tríadas sinápticas normales (2). sinapsis ectópicos no están presentes durante el desarrollo postnatal temprano, lo que sugiere que los fotorreceptores de los bastones se retraen sus terminales en las retinas - mutant nob2, dando lugar a consecuencia de los procesos de segundo orden para mantener el contacto sináptico. Otras cepas mutantes de ratón con el desarrollo de los fotorreceptores defectuoso o la transmisión sináptica también forman sinapsis ectópico en el ONL (3 ⇓ ⇓ -6). Sin embargo, no hay informes de defectos en los elementos de la tríada postsinápticos (células horizontales y bipolares) que conducen a la sinapsis ectópicos en las ONL de la retina del ratón (7 ⇓ ⇓ -10). defectos sinaptogénesis en fotorreceptores, células horizontales (HCS), y células bipolares son importantes para estudiar, ya que los cambios similares se producen en muchas retinopatías humanos y sus correspondientes modelos animales (11 ⇓ ⇓ ⇓ -15). En este estudio, hemos caracterizado el papel de retinoblastoma (Rb) en el desarrollo de HC y la sinaptogénesis (16). Rb, originalmente-tificado iden como un supresor de tumor, ahora se sabe que regulan diversos procesos celulares esenciales para el desarrollo normal. Poco después de que se generan, células recién postmitotic en la superficie apical de la retina que están comprometidas con el destino HC migran a su posición final justo debajo de la futura capa plexiforme externa (OPL). Durante esta migración, las células se extienden procesos apicales y basales que con el tiempo se retraen y se sustituye por la superposición de las proyecciones laterales a lo largo de la OPL cuando las células llegan a su posición final. Los procesos verticales conducen la formación del mosaico regular de los HC en la retina madura antes de la laminación (17). Se encontró que el Rb se requiere célula autónoma para medir el tiempo adecuado de maduración HC y la sinaptogénesis. Nuestro estudio proporciona un modelo valioso para estudiar la reorganización coordinada de los procesos apicales de HC durante la laminación y el inicio de la formación de tríada sináptica. resultados Asociación de Procesos apical HC y ectópicos sinapsis con las células deficientes en Rb de ratón retinas. El transgén Chx10-Cre se expresa en un patrón de mosaico en las células progenitoras de la retina durante el desarrollo y en un subconjunto de células bipolares diferenciadas y células de Müller (16. 18). Hemos informado procesos apical HC y sinapsis fotorreceptoras ectópicos en las ONL en Chx10-Cre; retinas Rb LOX / Lox pero no determinó si el defecto es autónomo a las neuronas horizontales (16). Para marcar las células que se sometieron a Cre mediada por recombinación con YFP indeleble y para determinar si los procesos apicales HC están asociados a regiones con déficit de Rb de retinas, generamos Chx10-Cre; Rb LOX / LOX; ratones Rosa-YFP. columnas apical-basal de células fueron YFP + en ratones en los días postnatales (P) P0, P7, P14, P21 y como en ratones adultos (Figura 1 A -. C). Todas las siete clases de tipos de células se identificaron dentro de las columnas YFP + por la morfología, posición laminar, y los estudios coimmunolocalization. Las secciones horizontales a través de la capa nuclear interna (INL) mostraron un patrón de mosaico irregular (Fig. 1 D y E). Una reconstrucción 3D (Fig. 1 C) y la puntuación de células por 25 campos de tres animales P21 independientes revelaron que las columnas de células marcadas fueron 14,3 ± 9,1 micras de diámetro en la INL. YFP expresión marca mosaico celular Rb-deficiente en Chx10-Cre; Rb LOX / LOX; Rosa-YFP retinas de ratones. (A) imagen confocal de expresión YFP en una columna de células en Chx10-Cre; Rb lox / lox; Rosa-YFP P18 retinas de ratón. (B) Superposición de expresión YFP (verde) con tinción nuclear con DAPI (azul) para resaltar la estructura laminar de la retina. tipos de células individuales se indican, incluyendo una celda de la capa de células ganglionares (punta de flecha). (C) 3D z - SERIES través de otra columna de células que se sometieron a la recombinación mediada por Cre-Lox de Rb y el gen reportero Rosa-EYFP. (D y E) la imagen confocal de una sección horizontal a través de la retina se muestra en A y B en el nivel de la porción apical de la INL, destacando el patrón de mosaico de la actividad del transgén Chx10-Cre. Punta de flecha indica parche mosaico de células deficientes en Rb, y la punta de flecha abierta indica una corrección de la retina normal. Am, células amacrinas; GCL, capa de células ganglionares; HC, célula horizontal; INL, capa nuclear interna; IPL, la capa plexiforme interna; es decir, segmentos internos de los fotorreceptores; Mu, las células de Müller; ONL, capa nuclear externa; OPL, la capa plexiforme externa. (Barras de escala: 10 micras). Para determinar si los procesos de HC ectópicos y sinapsis ectópicos se asocian con las regiones de la inactivación de Rb, se estudiaron los patrones de inmunotinción específica de células localizadas dentro de las tríadas o prolongaciones de las células HC, bipolares, y fotorreceptoras sinápticas. La inmunotinción se visualizó en el contexto del mosaico genético mediante coimmunolocalization con YFP en Chx10-Cre; Rb LOX / LOX; Rosa-YFP y Chx10-Cre; Rb LOX / +; retinas Rosa-YFP en P11-P14 y P18-P21. De los 100 procesos calbindina-immunopositive apicales marcado que se extendía al menos 10 micras en el ONL (seis retinas independientes en ambas etapas del desarrollo), 97 ± 1,4% (P11-P14) y 95 ± 2,1% (P18-P21) se asociaron con el mosaico deficiente en Rb (Fig. 2 A y B). las retinas de control no tenían procesos HC ectópicos. Para distinguir entre los axones y dendritas, se realizó coimmunolocalization con anticuerpos que reconocen neurofilamentos axonales y calbindina (SI Apéndice, Fig. S1). De los 177 procesos de HC ectópicos calbindina-immunopositive de siete retinas independientes analizadas en P14 y P21, la mayoría (92%; 164/177) fueron los axones. procesos de HC no se reorganizan en su posición laminar en Chx10-Cre; Rb LOX / LOX; Rosa-YFP retinas de ratones. (A) Coimmunolocalization de YFP (verde) y calbindina (rojo) en P21 Chx10-Cre; Rb LOX / LOX; Rosa-YFP retinas de ratones. procesos apicales (flechas) de HC calbindina-immunopositive están asociados con las regiones de la inactivación Rb (verde). (B) Asociación de los procesos apicales se obtuvo con respecto a la distancia de una columna de células deficientes en Rb, como se indica por la expresión de YFP. Una vez que se identificó el proceso de la cuba horizontal apical, se midió la distancia de la YFP + columna más cercana de las células, y los procesos se dividieron en un grupo 0-1μm (dentro de la columna de celdas o tocando la columna en el borde); un grupo 1-5 micras (dentro de aproximadamente un cuerpo de la célula de la columna); y una OPL, la capa plexiforme externa. (Barras de escala: 10 micras). Para determinar si las células bipolares PKCa-immunopositive extienden dendritas en las ONL, se examinaron 250 YFP + columnas de celdas (seis retinas independientes en P11-P14 y P18-P21) y marcamos el número de procesos PKCa-immunopositive ectópicos. procesos de las células bipolares ectópicos eran muy raros y no se extienden más allá de 10 micras en el ONL (Figura 2 C - E.); si está presente, los procesos PKCa-immunopositive ectópicos no estaban asociados con los procesos de HC ectópicos. Para extender nuestro análisis al cono células bipolares, se realizó coimmunolocalization con anticuerpos anti-GFP (19. 20) anti-calcio-proteína de unión 5 (Cabp5) y. No pudimos encontrar ninguna evidencia de dendritas cono bipolares ectópicos en Chx10-Cre; Rb LOX / LOX; ratones Rosa-YFP (SI Apéndice Fig S2..). Para validar estos datos de forma independiente, generamos Chx10-Cre; Rb LOX / LOX; ratones mGluR6-GFP que expresan GFP en células bipolares tanto de conos y bastones (21). No hubo evidencia para el tipo de procesos bipolares ectópicos reportados previamente en retinas, en la que se cree que los terminales para retraer en el ONL (SI Apéndice. Fig. S2). A continuación, se caracterizó la colocalización del fagot proteína de la cinta sináptica con YFP en Chx10-Cre; Rb LOX / LOX; Rosa-YFP y Chx10-Cre; Rb LOX / +; retinas Rosa-YFP en P11-P14 y P18-P21. Hemos visualizado 100 + columnas YFP (seis retinas independientes en P11-P14 y P18-P21) y marcamos el número de punctae ectópico fagot dentro de la región + YFP (SI Apéndice. Fig. S3 A ​​y B). También anotamos 100 YFP adyacentes - regiones. sinapsis ectópicos eran abundantes, con ~ 33% de columnas que contienen YFP + punctae bajón ectópico (SI Apéndice. Fig. S3 C) en cada etapa. Las columnas que contienen inmunofluorescencia bajón ectópico en las ONL tenían 3-21 punctae individuo (SI Apéndice. Fig. S3 D). Análisis de la proteína de densidad postsináptica 95 (PSD95), otra proteína sináptica localizada a los terminales fotorreceptoras (22), dio resultados similares (SI Apéndice Fig S3 E -.. H). Coimmunolocalization de calbindina y fagot mostró asociación de punctae bajón ectópico con terminales de procesos HC ectópicos en las ONL (SI Apéndice figura S3 I -.. K). Análisis genético de mosaico normal y ectópicos sinápticas Tríadas en el ratón retinas. Para caracterizar la estructura de las sinapsis ectópicos y para determinar si Rb tiene un papel de células intrínseca en este proceso, hemos generado Chx10-Cre; Rb LOX / LOX; ratones Z / AP, en la que todas las células de la retina que se someten a recombinación mediada por Cre son indeleblemente marcada con fosfatasa alcalina placentaria humana (MF). Un procedimiento de citrato-tinción de plomo modificado se utiliza para visualizar la expresión ABPP en las membranas de las neuronas individuales y procesos en micrografías electrónicas (16. 18). Por lo tanto, esta cepa de ratón es ideal para el análisis genético de mosaico en el plano individual-sinapsis (SI Apéndice. Figs. S4 y S5). Las micrografías electrónicas muestran que el patrón de mosaico de la recombinación mediada por Cre fue similar a la de la expresión de YFP de Chx10-Cre; Rb Lox / Lox; ratones Rosa-YFP (SI Apéndice Fig S4..). El número de cuerpos marcados bipolares celulares (21/56; 37%) y las tríadas sinápticas con las dendritas marcados (81/224; 36%) fue consistente con la expresión del mosaico del transgén Chx10-Cre (SI Apéndice S4 Fig..). Para determinar si los HC Rb-deficientes y células bipolares forman conexiones sinápticas normales, se analizaron 41 esférulas OPL en o cerca de áreas de células marcadas-MF para la presencia de HC marcado o procesos bipolares en la tríada sináptica. En el 68% de las tríadas (28/41), dendritas bipolares etiquetados y / o procesos de HC fueron identificados, con indicación de su origen a partir de MF-expresión de Rb deficientes en células bipolares o HC. sinapsis ectópicos fueron identificados en Cre; Rb LOX / LOX; retinas Z / AP, y los elementos marcados-MF estaban presentes en las sinapsis ectópicos (SI Apéndice S5 Fig..). La puntuación de 28 sinapsis ectópicos individuales para la presencia de procesos de HC etiquetados mostró que todas las sinapsis ectópicos contenían ABPP-etiquetados (deficientes en Rb) procesos horizontales. En una sinapsis ectópico retinas Rosa-YFP. seccionamiento de serie y la reconstrucción 3D de tríadas sinápticas individuales en la OPL y la ubicación ectópica en la ONL se utilizaron para determinar si Rb HC deficientes forman sinapsis invaginating con terminales fotorreceptoras en su localización ectópica (Fig. 3). Estos estudios confirmaron que las sinapsis ectópicos se invaginating sinapsis (Fig. 3 B y D) y, como se muestra en coimmunolocalization análisis, no contienen dendritas bipolares. cortes seriados y la reconstrucción 3D de tríadas sinápticas ectópicos y normales. micrografías (A) electrónica de secciones de serie de la etiqueta bipolar capa plexiforme externa que muestra elementos horizontales y en una tríada sináptica. la reconstrucción (B) 3D de micrografías en A con neuritas individuales horizontales que se muestran en las dendritas verde y azul y el trastorno bipolar se muestra en naranja. micrografías (C) electrónica de secciones seriadas de las ONL que muestra etiquetados elementos horizontales en una tríada sináptica ectópico. la reconstrucción (D) 3D de las micrografías en C con neuritas individuales horizontales que se muestran en verde y azul. No se observaron dendritas bipolares. Automatizado de puntuación de Rb con deficiencia de HC Morfología durante el desarrollo. La línea de ratones transgénicos Gad-67-GFP expresa GFP en los HC en desarrollo (17). Nuestro análisis microscópico de electrones mosaico genética demostró que virtualmente todos los procesos de HC apicales que forman sinapsis ectópicos estables se derivan de células deficientes en Rb. Por lo tanto, podemos controlar el desarrollo de los HC deficientes Rb que contribuyen a la sinapsis ectópicos mediante la caracterización de la morfología de las células con procesos apicales persistentes. Para ello, hemos generado Chx10-Cre; Rb LOX / LOX; ratones GAD67-GFP. campos múltiples se analizaron por microscopía confocal multifotónica que abarca las posiciones centrales-a-periférica en P4, P5, P6, P7, P8 y P12. La etapa entre P4 y P7 es crítica, porque los procesos de HC se someten columnar-a-lateral orientación laminar durante este período (17). Esta transición dramática puede ser visualizado en la reconstrucción 3D de imágenes confocales de la expresión de GFP en el control y Rb condicional retinas knockout (Fig 4 A -. H). procesos apicales que emanan de la HC deficiente en Rb pueden ser identificados en este curso de tiempo del desarrollo (Fig 4 A -. H). Reorganización de los procesos celulares horizontales durante el desarrollo. (A - D) multifotónica 3D imágenes confocales de campos representativos de control (A y B) y deficiente en Rb (C y D) que muestra retinas HC-GFP marcado en P4. Vista superior se muestra en A y C. y la vista lateral correspondiente se muestra en B y D. Las flechas indican los procesos apical y basal. marcas de la cuadrícula individuales corresponden a incrementos de 1 m. (E - H) multifotónica 3D confocal de imágenes de campos representativos de control (E y F) y deficiente en Rb (G y H) que muestra retinas HC-GFP marcado en P5. La vista desde arriba se muestra en E y G. y la vista lateral correspondiente se muestra en F y H. Las flechas indican procesos apicales todavía presentes en la ausencia de Rb. marcas de la cuadrícula individuales corresponden a incrementos de 1 m. (I y J) reconstrucciones 3D y calcos automatizados de un campo representativo de la expresión de GAD67-GFP en HC en el control (I) y las retinas deficiente en Rb (J). Las flechas indican procesos apicales todavía presentes en la ausencia de Rb. (K y L) histogramas que muestran la proporción de células con procesos verticales en cada etapa de desarrollo. Cada barra representa la media (± DE) de las retinas múltiples independientes y múltiples campos de visión dentro de cada retina. Los datos representados en la K corresponden a los resultados de rastreo Semimanual, y los de L corresponden a rastreo automatizado. Para cuantificar las características morfológicas de Rb-deficiente HC con precisión y compararlas con las células de tipo salvaje, hemos desarrollado una segmentación automatizada, esqueletización, y el algoritmo de rastreo (Fig. 4 I y J) (23) y probado por comparación con semimanual rastreo utilizando software Imaris para 275 células en múltiples etapas de desarrollo con trazados de algoritmo. Estos datos son concordantes para ambos conjuntos de datos y permite la puntuación de cientos de células a través de cada etapa. En los 1.181 HC analizados (disponibles bajo petición de datos), no hubo diferencia significativa en el tiempo de desarrollo general de la transición morfológica de vertical a lateral procesos celulares en Chx10-Cre; Rb Lox / +; GAD67-GFP y Chx10-Cre ; Rb LOX / LOX; retinas GAD67-GFP (Fig. 4 K y L). Para determinar si Rb HC deficientes con procesos apicales se asemejan a células inmaduras a partir de una etapa de desarrollo temprano o son un híbrido de células maduras y menos diferenciados, se utilizó el algoritmo para un análisis morfométrico detallada de HC con los procesos apicales en Chx10-Cre; Rb LOX / LOX; retinas GAD67-GFP (.. SI Apéndice figuras S6 y S7), y estos datos se compararon con los datos de la evolución en el tiempo de desarrollo. A P7 o posterior (P10-P12), la ramificación y los ángulos de los procesos ectópico en Cre; Rb Lox / Lox; GAD67-GFP HC fueron similares a los de HC de tipo salvaje inmaduros en las primeras etapas (P3, P6), pero los procesos fueron aproximadamente la mitad de la longitud de los de HC de tipo salvaje (SI Apéndice. fig. S6). Imágenes en vivo de los HC. El análisis del curso evolutivo momento de Chx10-Cre; Rb LOX / LOX; GAD67-GFP retinas sugiere que los HC apicales de células deficientes en Rb fallan para reorganizar lateralmente durante el desarrollo, debido a que estos procesos quedan dispuestas verticalmente en todas las etapas del desarrollo. Por el contrario, en otros modelos de ratón mutante en el que los terminales fotorreceptoras retraen o nuevos procesos se extienden dentro de la ONL formación de sinapsis ectópicos, hay un período en el que se ha producido la reorganización normal de columnar-lateral y no hay procesos ectópicos. Sin embargo, si el período de la formación de proceso del terminal de fotorreceptores retracción / nueva se solapa con la reorganización normal de columnar-lateral, la persistencia de los procesos apicales de HC que no reorganizan no puede distinguirse de la terminal de los fotorreceptores surgimiento de retracción / HC. Estas dos posibilidades se distinguían por imágenes en vivo de multifotónica Chx10-Cre; Rb LOX / LOX; retinas GAD67-GFP durante 18-24 horas a P6-P7 para visualizar los HC individuales durante esta transición crítica. Se presentan los datos de tres experimentos representativos (60 HC individuales) generados por el algoritmo. Una serie (Fig. 5 A y B) muestra varios procesos apicales que persistieron durante todo el curso de tiempo, así como otros procesos asociados con la celda y los procesos de las células vecinas se sometieron reorganización columnar-lateral. Este HC es una célula típica, que tiene el tipo de proceso apical HC caracterizado a lo largo del estudio. En el mismo campo, los cambios más dinámicos ocurrió cerca del cuerpo de la célula, en consonancia con la retracción / brotación de nuevos procesos (SI Apéndice Fig S8..); estos procesos no se extendía más allá de 10 micras apical a la OPL. Muchos HC también maduraron normalmente, mostrando procesos estables de la serie temporal de imágenes (SI Apéndice. Fig. S8). La longitud y la dinámica de los procesos en el transcurso de tiempo nos ha permitido clasificar y cuantificar cada proceso para todas las células en los tres experimentos (Fig. 5 C y D). Tomados en conjunto estos datos sugieren que la mayoría, si no todos, de los largos procesos apicales HC que forman sinapsis ectópico en la retina madura persisten desde temprano en el desarrollo y reflejan un defecto en la reorganización laminar de los procesos de HC en ausencia de Rb. N fotones de imágenes en vivo de HC en Chx10-Cre; Rb LOX / LOX; retinas GAD67-GFP. (A) Vista superior de un campo representativo con 20 HC. La flecha indica las células que se muestran en B. (B) Vista lateral (superior) de una sola célula con un proceso persistente apical (flecha) y el correspondiente trazado 3D de esa célula (inferior) en siete puntos de tiempo 1-H secuenciales representativos. procesos apicales se muestran en rojo. Las flechas indican un proceso de HC ectópico. (C) La longitud de los procesos se representan gráficamente para representar un proceso persistente apical (arriba), un proceso que mostró cambios dinámicos durante el transcurso de tiempo (brotación / retracción) (centro), y un proceso que se sometió a maduración normal (parte inferior). (D) Histograma de la proporción de células en tres experimentos con procesos apicales persistentes, cambios dinámicos en sus procesos (retracción / germinación), y los procesos normales. Discusión Aquí, mostramos que Rb celular contribuye de forma autónoma a los HC en el proceso crítico de la reorganización de sus neuritas a la posición laminar. En ausencia de Rb, procesos apicales persistentes forman sinapsis invaginating ectópicos con fotorreceptores dentro de la ONL. estudios Coimmunolocalization demostraron que la gran mayoría de los procesos ectópicos son axones, y esta observación es consistente con la presencia de terminales de varilla ectópicos (24. 25). Las sinapsis ectópicos son estables en las retinas de los adultos y no reciben la entrada sináptica de las dendritas bipolares. Estos resultados y conclusiones se basan en la aplicación única de microscopía electrónica de transmisión (TEM) basado en el análisis de mosaico genética en el desarrollo de los mamíferos CNA en el nivel de elementos sinápticas individuales. Aproximadamente el 33% de columnas mosaico de células YFP + tenía sinapsis HC ectópicos, un porcentaje que es ligeramente mayor que el porcentaje de columnas con cuerpos de YFP + HC. Por lo tanto, proponemos que la mayoría de los HC Rb-deficientes tienen defectos en la reorganización de algunos procesos durante el desarrollo. estudios de imagen y de desarrollo multifotónica vivo sugieren que los procesos ectópicos y sinapsis no son consecuencia de la retracción de los fotorreceptores terminal o neuritas que brota de los HC, y esta idea es apoyada por la ausencia de dendritas bipolares en las sinapsis ectópicos. En estudios de modelos de ratones genéticamente modificados o modelos de degeneración de la retina, los procesos apicales menudo el resultado de la retracción de la terminal de los fotorreceptores causado por un defecto en los propios fotorreceptores. En contraste, nuestros resultados muestran que los procesos columnares persistentes y sinapsis ectópicos resultado de un defecto de célula autónoma en una célula que forma contactos postsinápticos de la tríada de los fotorreceptores. En particular, la ausencia de Rb en ​​los HC en desarrollo no afecta a otros pasos en la diferenciación de HC como la migración y la sinaptogénesis en la OPL. Los estudios futuros sobre dianas moleculares de Rb en ​​los HC en desarrollo pueden ayudar a dilucidar las vías que regulan este proceso clave durante la neurogénesis de la retina. Rb, primero asociado con retinoblastoma, se ha implicado en muchos procesos celulares relacionados con la tumorigénesis y el desarrollo normal. Debido a que Rb se propone que es un regulador clave de los programas transcripcionales que facilitan la transición de la proliferación de células inmaduras a su progenie diferenciada terminalmente, se ha implicado en la diferenciación celular en varios tejidos y órganos. HC se basan en las interacciones entre los procesos apicales homotipica durante el desarrollo temprano y la migración de establecer un mosaico regular; al llegar a su posición laminar, los procesos de reorganizarse en cenadores laminares superpuestas (17). Se encontró que estos procesos apicales están cerca de los terminales fotorreceptoras medida que se extienden a través de la ONL hacia la OPL. Sin embargo, la sinaptogénesis por lo general no se inicia en el ONL; hay un retardo hasta que se reorganizan los HC y los terminales fotorreceptoras llegan a la OPL presuntiva. Una explicación para esto es que los procesos de coordinación de HC no son competentes para formar sinapsis cuando se extienden en sentido apical en las ONL en el desarrollo temprano, pero lo hacen sólo después de reorganizar a la configuración lateral; es decir, tanto en el momento y el lugar de terminales / procesos es clave para la sinaptogénesis. Proponemos un modelo para explicar el papel de Rb en ​​la maduración de HC. En ausencia de Rb, procesos horizontales apicales pueden adquirir la competencia para formar sinapsis con terminales fotorreceptoras en su orientación apical se extiende en el ONL. Si es así, entonces cuando un proceso de HC Rb-deficiente encuentra un terminal de fotorreceptor en desarrollo, inicia la sinaptogénesis ectópica en el ONL y se retiene en la retina de adultos. De acuerdo con este modelo, algunos procesos de Rb-deficiente HC pueden formar tríadas sinápticas normales en la OPL porque reorganizan en la posición lateral antes de que se encuentran con un terminal de fotorreceptores en la ONL. Unicelulares estudios de expresión génica de los HC de tipo salvaje Rb-deficiente y pueden arrojar luz sobre la red transcripcional que controla HC competencia sináptica. Materiales y métodos Ratones. Chx10-Cre; ratones Rb Lox / Lox se han descrito previamente (26). ratones Z / AP y RosaYFP se obtuvieron de Jackson Labs, y los ratones GAD-67-GFP (27) se han descrito previamente (17). El mGluR6-GFP también ratones se han descrito previamente (21). El Comité para el Cuidado y Uso de Animales de St. Jude aprobó todos los estudios con animales. Coimmunolocalization y microscopía confocal. Las retinas se aislaron en PBS y se fijaron durante 1 h en 4% (peso / vol) de paraformaldehído. retinas enteras fueron incrustadas en 4% (vol peso /) de agarosa en PBS y se cortaron en secciones de 50 micras en un vibratome. Las secciones se bloquearon en 5% (vol / vol) de suero de cabra normal, 0,5% (vol / vol) Triton X-100 en PBS durante 1 h a temperatura ambiente, y se incubaron en anticuerpo primario en la misma solución de bloqueo durante 1 h (SI Apéndice. Materiales y Métodos). Las imágenes fueron adquiridas con un microscopio confocal Zeiss LSM700. TEM y citrato de plomo de tinción. TEM y tinción citrato de plomo se realizaron como se ha descrito previamente (16). Los detalles se dan en el Apéndice SI. Materiales y Métodos. Los estudios de imágenes en vivo n fotones. montajes planos enteros retina se cultivaron durante 18-24 horas a 35 ° C en un medio de Ames oxigenada (pH 7,4) que contiene Hepes 20 mM, glucosa 40 mM, 100 U / ml de penicilina G, y 100 mg / ml de estreptomicina; la velocidad de perfusión fue de 1 ml / min. Microscopía de dos fotones de escaneo láser se realizó utilizando un sistema de imagen Ultima (Prairie Technologies) con un Ti: zafiro camaleón láser de femtosegundo Ultra-pulsos (920 nm) (coherente). Las imágenes fueron adquiridas con un 40 × 0,8 NA objetivo de inmersión en agua IR (Olympus). imágenes de ocho bits de 512 × 512 píxeles (0.223 m por píxel en el x - eje Y) con El Camino z-0,5 micras fueron adquiridas con un 20 × 0,8 NA objetivo de inmersión en agua IR (Olympus). Las imágenes fueron analizadas por el software Imaris (Bitplane) o nuestro algoritmo automatizado. Expresiones de gratitud Agradecemos a Marina Kedrov para obtener ayuda con el procesamiento de imágenes y la puntuación y Vani Shanker para la edición del manuscrito. Este trabajo fue apoyado en parte por el Centro de Cáncer programa de subsidios para CA21765 del Instituto Nacional del Cáncer; por subvenciones y EY014867 EY018599 de los Institutos Nacionales de Salud (a M. A.D.); Premio por Fogarty Colaboración Internacional de Investigación / Institutos Nacionales de Salud 1R03TW008344-01 (a M. A.D. y R. A.P. M.); por la Sociedad Americana del Cáncer; por la Fundación de Investigación para Prevenir la Ceguera; y por los sirios Caridad Asociada Americana del Líbano. ENOJADO. es un Instituto Médico Howard Hughes de Carrera Temprana Scientist. Notas al pie ↵ 1 R. A.P. M. y D. D. contribuido igualmente a esta labor. ↵ 2 a quien debe dirigirse la correspondencia. E-mail: michael. dyer stjude. org. Contribuciones de los autores: R. A.P. M. I. T.B. S. G. D. A.J. y M. A.D. investigaciones diseñadas; R. A.P. M. D. D. R. K. J. Z. I. T.B. D. H. M. K. S. F. S. G. D. A.J. y M. A.D. realizado investigaciones; R. K. S. G. S. S.Z. D. A.J. y M. A.D. contribuido nuevos reactivos / herramientas de análisis; R. A.P. M. D. D. R. K. S. F. S. G. D. A.J. y M. A.D. analizaron los datos; y R. A.P. M. R. K. D. A.J. y M. A.D. escribió el documento. Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses. ↵ * Este artículo Presentación Directa había un editor preestablecido.