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J. Folkman: "Aplicaciones clínicas de la investigación sobre la angiogénesis" la revista New England DE MEDICINA, vol. 333, no. 26, 28 de diciembre de 1995 (28/12/1995), páginas 1757-1763, XP000654557 BOSTON, MA, EE. UU. Abogado, agente o empresa: Gervasi, el Dr. Gemma (Notarbartolo y GERVASI Srl, Corso di Porta Vittoria, 9, Milano, 20122, IT) 1. Uso del componente B en combinación con un factor de crecimiento humano para la preparación de una composición para promover la angiogénesis. 2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el tratamiento de heridas, úlceras y otras lesiones traumáticas a cualquiera de los tejidos en el cuerpo. 3. Composición farmacéutica útil como cicatrizantes que comprende el componente B y un factor de crecimiento humana como principios activos en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. 4. Composición farmacéutica según la reivindicación 3, en el que los dos principio activo están presentes en una dosis de administración única. 5. Composición farmacéutica según la reivindicación 3, en el que los dos principio activo están presentes cada uno en una dosis de administración separada. 6. Composición farmacéutica según las reivindicaciones 3-5 en el que el factor de crecimiento humano es bFGF o VEGF. 7. Uso de Componente B, en combinación con un factor de crecimiento humano, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de heridas, úlceras y otras lesiones traumáticas a cualquiera de los tejidos en el cuerpo. Campo de la invención La presente invención se refiere al uso del componente B como agente angiogénico en combinación con factores de crecimiento humano. Lo último Componente B (indicada en lo sucesivo como CB) es una proteína de ácido 81 amino aislado originalmente de la orina humana. El gen humano que expresa la proteína se ha clonado y expresado en células CHO como recombinante componente B humana, la proteína tiene un peso molecular de aproximadamente 8,9 kD y se describe a fondo en el documento WO 94/14959 al que se hace referencia también para los métodos de preparación y su secuencia de aminoácidos. En WO97 / 39765 se describe el uso de CB como cicatrizante. También se sabe que los factores de crecimiento, como por ejemplo factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) tener actividad angiogénica. Breve descripción de los dibujos Figura 1: muestra el implante de un pellet cargado con ambos compuestos activos (1A) o de dos gránulos de cada carga con un compuesto activo (1B) en la córnea de conejo. Figura 2: muestra el efecto de bFGF y CB sobre la angiogénesis en la córnea de conejo. Figura 3: muestra el efecto de la inactivación térmica de la actividad angiogénica de CB. Figura 4: Muestra el efecto sinérgico de CB sobre la angiogénesis inducida por bFGF. Figura 5: muestra el efecto sinérgico de CB en la actividad angiogénica de bFGF. Figura 6: representa un dibujo de una sección histológica típica de córnea de conejo que ilustra las principales estructuras observables en los siguientes figuras 7-11. Figura 7: sección de córnea de conejo (x200) con un bolsillo corneal que contiene 100 ng de bFGF muestreada a 6 días después de la cirugía en la que las flechas indican los vasos neoformados. (Ep = epitelio). Figura 8: sección de córnea de conejo (x100) con un bolsillo corneal que contiene 500 ng de CB muestreada a 2 días después de la cirugía en la que las flechas indican los vasos neoformados. Figura 9: sección de córnea de conejo (x 200) con un bolsillo corneal que contiene 500 ng de CB muestreada a 6 días después de la cirugía en la que la flecha muestra vasos neoformados. Figura 10: Sección de córnea de conejo (x100) con un bolsillo de la córnea que contiene 4 g de CB muestreada a 15 días después de la cirugía en la que las flechas muestran vasos neoformados. Figura 11: Sección de córnea de conejo (x100) con un bolsillo de la córnea que contiene 500 ng de bFGF muestreada a 15 días después de la cirugía en la que la flecha muestra vasos neoformados. Figura 12: la media y el 95,0% de intervalo de Tukey HSD Descripcion detallada de la invencion Sorprendentemente, ahora se ha encontrado que la presencia simultánea de CB y un factor de crecimiento aumenta la respuesta angiogénica provocada por cualquiera de los agentes individuales, en otras palabras CB es capaz de sinergia con un factor de crecimiento para promover el crecimiento neovascular en los tejidos probablemente facilitando algunos eventos tempranos requeridos para movilizar las células endoteliales de los capilares. Un objeto de la presente invención es proporcionar el uso de CB en combinación con un factor de crecimiento para la fabricación de composiciones farmacéuticas útiles para el tratamiento de heridas, úlceras y otras lesiones traumáticas de cualquier tejido en el cuerpo. Otro objeto de la invención es una composición farmacéutica preparada como se describe anteriormente. La administración del ingrediente activo puede ser oral, intravenosa, intramuscular, subcutánea o tópica. Otras vías de administración, que pueden establecer los niveles sanguíneos deseados de los respectivos agentes activos están compuestos por la presente invención. La administración de los dos compuestos activos puede ser realizada por una única preparación farmacéutica que contiene los dos o, preferiblemente, por dos preparaciones farmacéuticas que contienen cada una por separado uno de los dos ingredientes. factores de crecimiento preferidos para ser utilizados en combinación con CB de acuerdo con la invención son factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). La angiogénesis se estudió en la córnea de conejos albinos ya que este es un tejido avascular y transparente donde las reacciones inflamatorias y capilares en crecimiento pueden controlarse fácilmente y cambios cuantificaron mediante el examen de microscopía estereoscópica (Ziche et al., 1982). Este método permite la monitorización durante un período prolongado de tiempo de crecimiento de los vasos por la observación directa traumática y no del proceso. Además en el mismo animal la cuantificación del efecto se puede comparar con la de un agente conocido. La investigación del papel de Componente B (CB) en la angiogénesis in vivo estudiado en el ensayo de la córnea del conejo se realizó por: a) probar la capacidad de la molécula para producir el crecimiento de vasos cuando se coloca en el estroma de la córnea avascular; b) probar la capacidad de la molécula para favorecer o reprimir la neovascularización provocada por el factor de factor de angiogénesis crecimiento de fibroblastos básico (bFGF) o factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF). métodos Protocolo para la preparación de liberación lenta de los compuestos de ensayo Los factores de crecimiento o péptidos se prepararon como gránulos de liberación lenta. gránulos de liberación lenta (1x1x0.5 mm) se prepararon en condiciones estériles incorporando las sustancias de ensayo en una solución de moldeo de un copolímero de etinil-vinilo (Elvax-40, Dupont, Wilmington, Delaware), en cloruro de metileno al 10% (10 l / gotitas) (Langer y Folkman, 1976; Ziche et al 1982).. Procedimiento quirúrgico La actividad angiogénica se ensayó in vivo usando el ensayo de córnea de conejo. En la mitad inferior de Nueva Zelanda ojo de un conejo blanco (Charles River, Calco, Lecco, Italia), anestesiados con pentotal de sodio (30 mg / kg), un bolsillo micro (1.5x3mm) fue producida quirúrgicamente utilizando un iris flexibles espátula 1,5 mm de ancho. Los gránulos se implanta en el microbolsas situadas en el estroma de la córnea avascular transparente. La cuantificación de las observaciones diarias posteriores de la angiogénesis de la córnea de los implantes se hicieron con un estereomicroscopio de lámpara de hendidura sin anestesia. Una respuesta angiogénica se calificó como positivo cuando gemación de los vasos de ocurrió el plexo limbal después de 3-4 días y capilares progresaron a alcanzar el sedimento implantado según el esquema se informó anteriormente (Ziche et al. 1989). La actividad angiogénica se expresa como el número de implantes que presentan neovascularización en los implantes totales estudiados. La potencia se obtuvo por el número de vasos de neoformación y por su velocidad de crecimiento. Los datos se expresan como puntuación de la angiogénesis, calculado como la densidad de vasos x distancia de limbo en mm. Un valor de densidad de 1 corresponde a 0 a 25 vasos por córnea, 2 de 25 a 50, 3 50 a 75, 4 75 a 100 y 5 para más de 100 vasos (Ziche et al. 1994). Diseño experimental El efecto del componente B se ensayó después de dos procedimientos: A) tres concentraciones diferentes de la molécula se ensayaron en la córnea de al menos 4 conejos distintas por cada dosis, para definir el potencial de la actividad angiogénica del compuesto. El efecto del componente B se comparó con la provocada por el factor de crecimiento bFGF en 50 y 100 Nag / pellet. En este protocolo experimental conejos fueron controlados durante 3 semanas. B) Para evaluar un posible papel del Componente B en la modulación de la angiogénesis el efecto de este agente se ensayó en presencia de un factor de angiogénesis definido, es decir, bFGF. Para este objetivo dos bolsillos adyacentes fueron producidos quirúrgicamente en la misma córnea, uno que tenga el gatillo angiogénico y el otro componente B. Los experimentos también se realizaron pruebas de ambas sustancias incorporadas en la misma pastilla (Figura 1). Este último protocolo experimental fue creado específicamente por nuestro grupo para definir: 1) el efecto del agente como un "coestimulador" de la angiogénesis provocada por bFGF; o 2) la capacidad del agente para inhibir la angiogénesis provocada por el factor de crecimiento (Ziche et al, 1992 y 1994). En este protocolo experimental se controlaron los conejos durante 4-5 semanas. El mismo protocolo se utilizó para probar el efecto de CB como "coestimulador" de la angiogénesis inducida por VEGF. El análisis histológico córneas de conejo con bolsillos corneales que contienen CB y / o bFGF se tomaron muestras a los 2, 6, 15 días después de la cirugía, y se fijaron en formalina después de la eliminación de los pellets. procesamiento histopatológico de rutina se realizó; secciones de 5μm de espesor fueron cortadas al lado de donde se colocó cada sedimento; secciones fueron teñidas con hematoxilina. Al menos 40 secciones fueron examinadas por cada córnea. análisis estadístico Los resultados se expresan como medios para (n) implantes. datos de puntuación angiogénicos contenían resultados tanto positivos como negativos. Se realizaron comparaciones múltiples por ANOVA de una vía y las diferencias individuales se ensayaron por el test de Fisher después de la demostración de las diferencias significativas entre los grupos por ANOVA. Un valor de p de 0,05 se tomó como significativo (véase también el apéndice para su posterior evaluación estadística). resultados a) La actividad angiogénica de CB La actividad angiogénica de CB se ensayó después de la incorporación de concentraciones crecientes del compuesto en gránulos de liberación lenta del polímero Elvax-40. La solubilización e incorporación del compuesto en los gránulos de polímero no causan ningún problema específico. Las dosis ensayadas fueron: 0,2, 0,5, 2 y 4 mg / pellet. El efecto de CB se comparó con la producida por el factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF). CB provocó un efecto angiogénico dependiente de la dosis que parecía ser más débil que la provocada por bFGF. En la Figura 2A se reportan los datos sobre la actividad angiogénica de bFGF obtenido a partir de experimentos anteriores y de los experimentos llevados a cabo en paralelo con el CB. En los datos de la Figura 2B de la observación diaria de córneas de conejos implantados con pastillas que contienen CB-son reportados como puntuación angiogénico. La puntuación más alta obtenida angiogénico con un promedio de alrededor de 3-3,5 CB (2-4 mg / pastilla) (P0.05 vs pellets de vehículo solo). CB no se angiogénicos a la concentración de 0,2 mg / pellet. Como se muestra en la Tabla 1, 0,5 mg / pellet CB indujo una respuesta angiogénica positiva en 1 implante de 5 realizado. Dos y 4 mg / pellet fueron las dosis más eficaces. Estas dosis indujeron una actividad angiogénica similar y producen 2 implantes positivos de 5 realizado. CB estaba desprovisto de cualquier actividad inflamatoria macroscópica como lo revela la persistencia de la transparencia corneal a lo largo de los experimentos en cualquier concentración ensayada. Para evaluar la especificidad de CB efecto angiogénico, el compuesto fue inactivado por calor (H. I.) por ebullición durante 20 min. a continuación, se puso a prueba la dosis de 2 g. Después de la inactivación por calor CB perdió completamente la actividad angiogénica (Fig. 3) (P0.05 vs 2μg CB). b) Efecto de la CB en la angiogénesis inducida por bFGF Para evaluar el papel potencial de CB en la modulación del efecto de un efector angiogénico conocido, los experimentos se llevaron a cabo pruebas de concentraciones subóptimas de ambas sustancias (500 ng de CB y 100 ng de bFGF) coreleased en el estroma corneal. Los experimentos se realizaron pruebas de ambas sustancias incorporadas en la misma pastilla (Fig. 1A). Además, los compuestos se ensayaron a la misma concentración que el anterior pero liberados en el estroma por separado en 2 pastillas independientes (Fig. 1B). La presencia simultánea de CB y bFGF en la córnea aumentó la respuesta angiogénica provocada por cualquiera de los agentes individuales (Fig. 4A y B, Tabla 2). La angiogénesis se produjo antes y progresó más rápidamente produciendo un incremento significativo del número de vasos de neoformación (P0.05 vs CB y bFGF solo). Este efecto fue evidente en ambas condiciones experimentales. Sin embargo, cuando CB y bFGF fueron puestos en libertad de forma independiente por 2 bolitas separadas el efecto fue mayor. Los capilares crecieron hacia bFGF en lugar de CB CB lo que sugiere que contribuyó a potenciar la actividad de bFGF. Después de 7 días, el crecimiento neovascular comenzó a retroceder. Se realizaron experimentos adicionales con concentraciones crecientes de CB (0,2, 0,5 y 2 mg / pastilla) en la angiogénesis provocada por una concentración constante de bFGF (100 ng). Una sinergia entre las dos moléculas se observó (Fig. 5). Curiosamente, se observó el estado más eficaz de sinergismo entre CB y bFGF con 200 ng CB (P0.05 vs CB y bFGF solo) probado en dos pastillas separadas. c) Efecto de la CB en la angiogénesis inducida por VEGF En la Tabla 3 se describe el efecto sinérgico del componente B sobre la angiogénesis inducida por VEGF. El sinergismo entre CB y VEGF se evaluó con los factores analizados en dos pastillas separadas. Los resultados obtenidos en el día 10 se presentan en la Tabla 3. Los datos se expresan como el número de implantes que presentan neovascularización con una angiogénesis puntuación igual o mas para 6, en los implantes totales realizadas. Además análisis estadístico se realizó con el fin de confirmar las posibles interacciones positivas entre los compuestos de ensayo utilizando un análisis más conservador (véase la Fig. 11 en el Apéndice). Los principales factores ( "compuestos de ensayo" y "puntuación angiogénico" con el tiempo) se analizaron de acuerdo con el análisis de factores múltiples. Los resultados mostraron que las diferencias estadísticamente significativas (p0.0001) están presentes entre los compuestos de ensayo en el tiempo. En cuanto a la interacción entre los compuestos de ensayo de los resultados de la prueba de Tukey permiten las siguientes consideraciones (ver Fig 12 a continuación.): CB 500 ng + bFGF 100 ng (1 pellet) Ambos compuestos no son individualmente estadísticamente diferentes de los controles. La combinación de los dos compuestos dio una respuesta que es estadísticamente diferente de cualquiera de los controles y los fármacos individuales. La respuesta es de alrededor el efecto aditivo esperado. CB 200 ng de bFGF + 100 ng (2 bolitas) Ambos compuestos no son individualmente estadísticamente diferentes de los controles. Los. combinación de los dos compuestos dio una respuesta que es estadísticamente diferente de cualquiera de los controles y los fármacos individuales. Además, hay que señalar que la respuesta de los tratamientos combinados excede claramente el efecto aditivo esperado. Lo anterior parece confirmar la presencia de un efecto sinérgico entre los dos fármacos. CB 500 ng de bFGF + 100 ng (2 bolitas) Ambos compuestos no son estadísticamente diferentes de los controles. La combinación de los dos compuestos dio una respuesta que es estadísticamente diferente, ya sea a partir de los controles y los fármacos individuales. La respuesta es de alrededor el efecto aditivo esperado. Además, no se encontraron diferencias comparando CB 500 ng 100 ng + bFGF (1 pellet) vs CB 500 ng + 100 ng de bFGF (2 pellet). CB 2 mg + 100 ng de bFGF (2 bolitas) Ambos compuestos no son estadísticamente diferentes de los controles. La combinación de los dos compuestos dio una respuesta que es estadísticamente diferente de los controles, pero no de los compuestos individuales. La respuesta es de alrededor el efecto aditivo esperado. El análisis histológico El efecto de CB fue examinado en la concentración eficaz máxima (4 g) y a una concentración subóptima (500 ng) en presencia y en ausencia de bFGF (100 ng). No hay diferencia en el grado de infiltrado celular fue evidente entre los implantes de CB y bFGF en cualquier combinación (. Figs 7,8,9). Dentro de 2 días a partir de los implantes un infiltrado de leucocitos rodeado de una densa red de capilares recién formados en la proximidad de la región limbal en el lado epitelial de la córnea (Fig. 10). Al día 6 una reducción consistente en la extensión del infiltrado de leucocitos era evidente mientras que los vasos capilares parecían aumentaron en número y calibre en respuesta a cualquiera molécula (Fig. 11). Al día 15 en la medida del infiltrado de leucocitos fue insignificante mientras capilares aparecieron morfológicamente sin modificar. conclusiones Componente B posee actividad angiogénica que es aparente en el intervalo de concentración de microgramos y que se pierde por la inactivación por calor. La mayoría de los factores de angiogénesis son angiogénico en concentraciones de 20-40 veces menor. Junto con la alta concentración requerida para provocar la angiogénesis, 2 aspectos relevantes aparecen en efecto CB: 1) la capacidad de provocar brotación de capilares dentro de los primeros 3-4 días desde el implante, imitando el factor VEGF angiogénesis secretada en vez de la matriz ligada factor de angiogénesis bFGF; 2) el aplanamiento en el tiempo de la eficiencia del crecimiento neovascular, que conduce a sólo el 30-40% del implante probado ser completamente vascularizado después de 10-14 días. Nuestros resultados indican que CB induce angiogénesis in vivo y tiene la capacidad para crear sinergias con bFGF en la promoción del crecimiento neovascular en la córnea de conejo. Estas consideraciones, junto con las características de la potenciación de la respuesta angiogénica en presencia de bFGF, sugieren que CB requiere la presencia de factores de crecimiento adicionales para expresar plenamente su potencial angiogénico in vivo. El examen histológico de secciones de córnea de la muestra a diferentes intervalos de tiempo se realizó para evaluar si el proceso de la angiogénesis provocada por CB involucrado infiltrado de células inflamatorias. El efecto de CB se comparó con la producida por el implante corneal de bFGF. En el examen histológico de rutina no encontramos grandes diferencias en el grado y en el tipo de infiltrado de leucocitos en las córneas que reciben CB, bFGF o la combinación de los dos. Así, de nuestros resultados podemos concluir que la vascularización corneal inducido por CB no parece estar mediada por los productos de reacción brutos inflamatorios ya que ninguna señal de opacidad de la córnea era evidente. La característica de la respuesta angiogénica provocada en la córnea avascular de CB CB sugiere que podría facilitar algunos de los primeros eventos requeridos para movilizar las células endoteliales de los capilares. Una vez que se inicia este proceso y las células endoteliales son "aflojada" desde el límite ajustado a la matriz extracelular, bFGF expresa su efecto mitogénico con más eficiencia. Efecto del componente B sobre la angiogénesis en la córnea de conejo
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